【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.21】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24UT0237
利用課題名 / Title
タンパク質構造のフリーラジカルによる影響の解明
利用した実施機関 / Support Institute
東京大学 / Tokyo Univ.
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
内部利用（ARIM事業参画者以外）/Internal Use (by non ARIM members)
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）計測・分析/Advanced Characterization（副 / Sub）-
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）マテリアルの高度循環のための技術/Advanced materials recycling technologies
キーワード / Keywords
電子スピン共鳴装置,生分解性材料/ Biodegradable material,資源循環技術/ Resource circulation technology
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
黄 秋源
所属名 / Affiliation
東京大学農学生命科学研究科 生物材料科学専攻
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
Le Duc Anh ,石田 正雪
利用形態 / Support Type
（主 / Main）技術補助/Technical Assistance（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
酵素は、構造の安定性がその活性と密接に関連しています。特に高温条件下では、酵素が変性して凝集したり、活性を失ったりすることがあります。
電子スピン共鳴装置（日本電子製JES-FA300）は、ラジカル生成や分子運動を高感度で検出できる。この特性を活用して、高温条件下での酵素の変性挙動をモニタリングし、酵素の耐熱性を評価します。
DMPOはスピントラップ剤として知られており、一過性のラジカルを安定したラジカルアダクトに変換する能力があります。この特性を利用し、酵素の熱変性に伴うラジカル生成をモニタリングすることで、耐熱性を評価します。高温で酵素が変性すると、ラジカルが生成される可能性があります。このラジカルがDMPOと反応し、特異的なESRスペクトルを示すことで、変性の進行状況を可視化できます。
実験 / Experimental
1. 試薬と装置酵素試料: モデル酵素（例: リゾチーム、アルカリホスファターゼ）緩衝液: 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）スピントラップ剤: DMPO（100 mM）2. 測定条件温度範囲: 25°C ～ 90°C（10°C刻み）測定時間: 各温度で15分間インキュベート後に測定サンプル濃度: 酵素濃度1 mg/mL対照群: DMPOのみを含む緩衝液（酵素なし）3. 測定項目DMPOラジカルアダクトの生成: 高温での酵素変性に伴うラジカル生成を観察。Hydroxylラジカルや酸素ラジカルなど、生成されたラジカルの種類に基づくESRスペクトルの解析。ラジカル生成量: ラジカル強度の温度依存性を評価。
結果と考察 / Results and Discussion
初回のみを使ったため、主に装置の使い方を習った。予測した結論と考察DMPOを用いたESR測定により、酵素の変性過程で生成されるラジカルの検出が可能。ラジカル生成量の温度依存性を分析することで、酵素の耐熱性や変性温度を特定でき、ESRデータにより、以下の反応メカニズムを推測できる。
低温（25°C～50°C）: 酵素は安定しており、ESRスペクトルにはほとんどラジカル生成の信号が現れない。ラジカル強度は非常に低く、変性の兆候は見られない。中温（60°C～70°C）: 酵素が部分的に変性し、ラジカル生成が増加する。ESR信号がわずかに強くなり、変性の開始を示す。高温（80°C～90°C）: 酵素が完全に変性し、活性を失い、ラジカル信号が顕著に増加する。ラジカル強度が急激に高まり、ESRスペクトルが変化する。このように、温度上昇に伴うラジカル生成の変化を追跡することで、酵素の耐熱性限界や変性の開始温度を非破壊的に特定できる。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
以下の東大ARIMのESR担当の方にお礼申し上げます。
Le Duc Anh 先生
石田 正雪 さん
森山 和彦 さん コーディネート室長
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件