【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.04.30】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24UT1211
利用課題名 / Title
核酸バイオセンサデバイスの開発
利用した実施機関 / Support Institute
東京大学 / Tokyo Univ.
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
外部利用/External Use
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）加工・デバイスプロセス/Nanofabrication（副 / Sub）-
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）高度なデバイス機能の発現を可能とするマテリアル/Materials allowing high-level device functions to be performed（副 / Sub）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials
キーワード / Keywords
新型コロナウイルス、オリゴヌクレオチド,センサ/ Sensor,バイオセンサ/ Biosensor,スパッタリング/ Sputtering
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
坂元 博昭
所属名 / Affiliation
福井大学学術研究院工学系部門繊維先端工学分野
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
天谷諭
利用形態 / Support Type
（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
UT-711：LL式高密度汎用スパッタリング装置 (2018)
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）は収束したものの、今後も感染力の強い変異株の発生や、未知のウイルスによるパンデミックが引き続いて起こることも不安視されている。新たなパンデミックによる被害を最小限に抑えるウイルス対策として、感染者をより早く正確に管理することも一つの重要事項である。したがって、高性能機器に依存しない、より簡便な工程で行うことのできる高感度な核酸検出法が求められる。本研究では、オリゴヌクレオチドプローブ修飾粒子の溶液中での回転ブラウン運動に着目し、POCT(Point of care testing)としての応用が多数報告されている画像解析による高感度な核酸検出系の構築を試みた。Janus粒子のAuコーティング半面にプローブを修飾し、半面を蛍光にすることでプローブ修飾Janus粒子を作製し、その回転ブラウン運動から画像解析により相関時間を算出することで、より簡便にRNAを測定可能にする核酸検出系の開発を目的としている。標的RNAに対して相補的な配列を持つプローブを分子認識素子として用い、プローブ修飾Janus粒子と標的RNAとの複合体を形成させ、粒子径を拡大させることで拡散度を低下させるため相関時間が増大する。
実験 / Experimental
1． プローブ修飾Janus粒子の作製・評価： オゾン/UV処理機により親水化したスライドガラスに50倍希釈した1.0 µm PS蛍光粒子溶液を滴下し、完全に乾燥させることで、蛍光PS粒子層を作製した。その後、蛍光粒子層に対し親水化処理を行った後に、Ti 5 nm、Au 10 nmをスパッタリングすることで半面のみがAuコーティングされたJanus粒子を作製した。スライドガラス上のJanus粒子は、超音波処理でスライドガラスから剥離し、遠心分離により回収した。その後、回収したJanus粒子のAu表面にチオール修飾された標的RNA捕捉用プローブ(5’-GGT ATT TCT ACT ACC TGG GC-Thiol-3’)を修飾した。Janus粒子は、電界放出形走査電子顕微鏡(FE-SEM)とエネルギー分散型X線分光法(EDS)を用いて形態観察および元素分析を行った。2．プローブ修飾Janus粒子を用いた標的RNAの検出： SARS-CoV-2のNタンパク質の塩基配列を持つプラスミドDNAから特定の塩基配列を増幅させ、転写、精製を行い標的RNA (1260 nt) を得た。作製したプローブ修飾粒子と標的RNA溶液を混合し、ハイブリダイゼーションを行うことで、プローブ修飾Janus粒子-標的RNA複合体を形成させた。複合体をスライドガラス上に1.5 µL滴下し、蛍光顕微鏡で観察を行い、1824×1216 pixel、15 fpsの条件で動画を20秒撮影した。ImageJを用いて撮影動画を1フレームごとに分割し、MATLAB コードを使用し相互相関分析することで相関時間を算出した。RNAの有無はRNA非存在条件の相関時間の値を基準とした相対相関時間(Relative correlation time)で比較を行った。Fig.１に画像解析に基づく標的RNA検出系の流れを示す。
結果と考察 / Results and Discussion
Janus粒子をFE-SEM/EDSにより形態観察および元素分析を行った結果、粒子上部は均一なAuの層が形成され、粒子下部につれてAuが減少していくことを確認した。作製したJanus粒子を用いて、その拡散挙動変化に基づく生体試料中の標的RNA検出性能を調査した。標的RNA濃度が100 aM以上のサンプルにおいて相対相関時間の増大が確認された。これは、標的RNAとJanus粒子に修飾されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションしたことにより複合体を形成し、さらにRCA産物との複合体を形成させることによって粒径の拡大量がより増大したから だと考えられる。以上より、本検出系は100 aMの標的RNAが検出できることが示唆された。さらに本検出系の標的RNAに対する特異性・選択性の評価を行うために、夾雑物として合成DNAを含んだサンプル中で検出を試みた。本検出系は標的RNAに対する特異性・選択性を有することが示唆された。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
Fig.1 画像解析に基づく標的RNA検出系の流れ
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
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Maho Koda, A novel RNA sensor based on dynamics of oligonucleotide-functionalized Janus particles driven by rotational diffusion, Sensors and Actuators A: Physical, 379, 115920(2024).
DOI: https://doi.org/10.1016/j.sna.2024.115920
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件