【公開日：2025.07.31】【最終更新日：2025.07.31】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
22MS5020
利用課題名 / Title
天然および人工高分子分解酵素の機能解析
利用した実施機関 / Support Institute
自然科学研究機構 分子科学研究所 / IMS
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
内部利用（ARIM事業参画者以外）/Internal Use (by non ARIM members)
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis（副 / Sub）計測・分析/Advanced Characterization
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）マテリアルの高度循環のための技術/Advanced materials recycling technologies（副 / Sub）-
キーワード / Keywords
キチン分解酵素,バイオマス変換
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
中村 彰彦
所属名 / Affiliation
分子科学研究所/静岡大学農学部応用生命科学科
共同利用者氏名 / Names of Collaborators Excluding Supporters in the Hub and Spoke Institutes
田中 淑子
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Supporters in the Hub and Spoke Institutes
利用形態 / Support Type
（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
セラチア菌由来キチン加水分解酵素A(SmChiA)は、結晶性キチン上を運動しながら連続的に分解反応を起こすことで、物理化学的に安定な結晶性キチンを効率的に分解できる。運動の際にはキチン分子鎖の活性中心への結合、グリコシド結合の加水分解、生成物であるジアセチルキトビオース(NAG2)の放出、分子鎖のスライド、キチン分子鎖の活性中心への再結合を繰り返す。生成物の結合及び分子鎖のスライド中間体構造に重要であると考えられるTrp295の役割を検証するため、天然型SmChiAとW295A変異体へのNAG2の結合をITCを用いて計測した。
実験 / Experimental
天然型SmChiAとW295A変異体酵素を、大腸菌を宿主として発現させた。Niアフィニティ精製及びゲル濾過精製ののち、酵素を濃縮した。安定した計測のため、酵素濃縮時に分離した溶液を用いてNAG2を溶解し、リガンド溶液を作成した。酵素溶液をセルに封入し、シリンジにセットしたNAG2溶液を滴下しながら熱量変化を測定した。
結果と考察 / Results and Discussion
天然型SmChiA 10 μMに対してNAG2 200 μMを投入したが熱量変化が観測できなかった。そこで酵素濃度を200 uM, 基質濃度を100 mMとして再度計測したところ発熱反応が観測できた。2サイトモデルでのフィッティングの結果、結合数0.9でKd=1.3 mMの主要結合サイトと結合数3.5でKd=750 mMのマイナー結合サイトが推定された。同様の条件でSmChiA W295A変異体とNAG2の結合を計測したが、希釈熱しか観測できなかった。このことからフリーのSmChiAへの NAG2 の結合は、Trp295を介しておこっていると考えられた。結合状態の特定のため、現在NAG2を含んだ結晶の構造解析を試みている。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件