【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.12】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

24OS0006

利用課題名 / Title

ATP動態を担う蛋白質の構造解析

利用した実施機関 / Support Institute

大阪大学 / Osaka Univ.

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

外部利用/External Use

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）計測・分析/Advanced Characterization（副 / Sub）-

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）マルチマテリアル化技術・次世代高分子マテリアル/Multi-material technologies / Next-generation high-molecular materials（副 / Sub）-

キーワード / Keywords

電子顕微鏡/ Electronic microscope

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

横山 謙

所属名 / Affiliation

京都産業大学 生命科学研究科

共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes

津山泰一

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes

光岡薫

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）,技術補助/Technical Assistance

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

OS-004：300kVクライオ電子顕微鏡

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

生命の維持にはエネルギーが必要であり、生命がエネルギーを使いやすい形に変え、それを使う仕組みを研究するのが、生体エネルギー学 (Bioenergetics) である。生命のエネルギー通貨である ATPは、主にミトコンドリアに存在するATP合成酵素により作られる。作られたATPは、生物が運動することや、生体分子の合成、分解、輸送などに使われる。たとえば、液胞型プロトンATPase (V-ATPase)は、ATPを使って小胞内にイオンを輸送し、その酸性化を通して様々な生理現象を担う。V-ATPase のように、ATPを使って基質を運ぶタンパク質は輸送体と呼ばれ、その仕組みは、それぞれの輸送体の構造を明らかにすることでだいぶわかってきたが、不明な点も残っている。ちっぽけなタンパク質からなる分子機械がどうやってATPのエネルギーを輸送や運動に変換するのかは、とても興味深い問題であり、解決すべき生命科学の課題の一つである。この分子機械の仕組みを解明するには、その動きと形を見る必要があり、そのための手法として我々はクライオ電顕による構造生物学を行った。

実験 / Experimental

本研究では、好熱菌Thermus thermophilus 由来のATP合成酵素を材料として、クライオ電子顕微鏡法によって、その構造を原子レベルで明らかにすることを目的とした。ATP合成酵素全体の構造は、親水性部分と膜内在性部分が相対的に動くため、高分解能の構造を得ることは困難である。本研究では、酵素全体に加え、膜内在性部分だけを取り出して、その構造解析を行った。加えて、ATP動態に関係する ATPを透過させるラージポアタンパク質である PANX3 の構造解析を行った。PANX3は、培養細胞で発現させたものを affinity 精製し、クライオ電顕による構造解析に供することで、その構造を決定した。

結果と考察 / Results and Discussion

今回、単離した膜内在性部分の構造を最大分解能2.8 Å で決定した（図１）。その結果、膜内在性部分のaサブユニットとc₁₂リングの間に複数の水分子を同定することができた（図1C）。水分子は、プロトンを輸送するうえで道筋となる重要な分子である。また、プロトンを輸送するために重要なc₁₂リングのアミノ酸残基（63番目のグルタミン酸/E63）が、プロトンの結合状態によって向きがことなることを確認した（図1D）。今回、アポ型のPANX3の構造をクライオ電子顕微鏡により 2.9Åという高分解能で解明した。決定されたPANX3チャネルは7量体で、中心対称軸に沿って膜貫通孔を形成していた。孔の最も狭い狭窄部は細胞外領域に位置するイソロイシン環で構成され、その大きさは他のパネキシンと同程度であった。構造変異解析 (Structural Variability analysis)の結果、細胞内領域における顕著な構造ダイナミクスが明らかになり、パネキシンチャネルの詳細な特性を理解するための構造基盤を解明することができた。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

図1.　Vo の構造

図2.  PANX3 のクライオ電顕構造

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

1. Ren Kobayashi, ADP-inhibited structure of non-catalytic site-depleted FoF1-ATPase from thermophilic Bacillus sp. PS-3, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1866, 149536(2025).
   DOI: 10.1016/j.bbabio.2025.149536
   
2. Taiichi Tsuyama, Cryo-EM structure of the human Pannexin-3 channel, Biochemical and Biophysical Research Communications, 745, 151227(2025).
   DOI: doi.org/10.1016/j.bbrc.2024.151227
   
3. Jun-ichi Kishikawa, Rotary mechanism of the prokaryotic Vo motor driven by proton motive force, Nature Communications, 15, (2024).
   DOI: 10.1038/s41467-024-53504-x
   

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

1. 哺乳類V-ATPaseの阻害剤結合構造の解明　上田楓華　西田結衣　中野敦樹　中西温子　光岡薫　横山謙　第24回日本蛋白質科学会年会　会場　札幌コンベンションセンター　6/2024 ポスター発表
2. Structural analysis of mammalian V-ATPase.　西田結衣　中西温子　中野敦樹　上田楓華　光岡薫　横山謙　第24回日本蛋白質科学会年会　会場　札幌コンベンションセンター　06/2024 ポスター発表
3. Pannexin-3の構造解析　寺村龍河　津山泰一　横山謙　第24回日本蛋白質科学会年会　会場　札幌コンベンションセンター　6/2024　ポスター発表
4. 脂質二重膜に組み込まれた機能中膜タンパク質のクライオ電子顕微鏡単粒子解析　中野　敦樹　第24回日本蛋白質科学年会 6/2024 ポスター発表
5. Structural analysis of ATP synthases embedded in a lipid bilayer under proton motive force by cryoEM. 中野敦樹 IUPAB2024 6/2024 ポスター発表udent and Early Career Researcher Poster Award

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件