【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.05.20】
課題データ / Project Data
課題番号 / Project Issue Number
24MS1028
利用課題名 / Title
先端電子スピン共鳴法を用いた酵素ダイナミクスの実測
利用した実施機関 / Support Institute
自然科学研究機構 分子科学研究所 / IMS
機関外・機関内の利用 / External or Internal Use
外部利用/External Use
技術領域 / Technology Area
【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）物質・材料合成プロセス/Molecule & Material Synthesis（副 / Sub）計測・分析/Advanced Characterization
【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）マテリアルの高度循環のための技術/Advanced materials recycling technologies（副 / Sub）-
キーワード / Keywords
スピンラベル, 酵素, 低温適応酵素, 金属タンパク質, ダイナミクス, 構造変化, 構造ゆらぎ, 創薬研究, DEER,分離・精製技術/ Separation/purification technology,未利用資源の有効利用技術/ Technologies for effective utilization of unused resources
利用者と利用形態 / User and Support Type
利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)
矢垰 紅音
所属名 / Affiliation
鹿児島大学大学院連合農学研究科
共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes
堀谷 正樹
ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes
横山 利彦,中村 敏和,浅田 瑞枝,上田 正,藤原 基靖,宮島 瑞樹,伊木 志成子
利用形態 / Support Type
（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-
利用した主な設備 / Equipment Used in This Project
報告書データ / Report
概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)
タンパク質などの生体分子は、リガンドの結合や外部からの摂動などに対してその構造を動的に変化させることで機能を発揮する。つまり、タンパク質の産業的応用や創薬研究のためには、そのタンパク質の構造と機能の相関を明らかにする必要がある。我々はタンパク質の構造変化ダイナミクスに注目し、以下の2種類のタンパク質について構造-機能相関の解明を目指した。構造変化ダイナミクス解析には電子-電子二重共鳴法（DEER）を用いた。DEERでは2つの不対電子間の距離（20〜80Å）を測定することができるため、標的タンパク質に不対電子を持つ化合物（スピンラベル）を付加し、ラベル間距離の変化をDEERで観測することで構造変化を調べた。
① 化膿レンサ球菌由来金属獲得タンパク質MtsA
グラム陽性菌に属する化膿レンサ球菌は、ヒトの咽頭や皮膚に感染して感染症を引き起こす。金属イオンは菌にとって必須の栄養源であることから、金属獲得タンパク質MtsAに対する創薬研究が行われてきた。ところが、これまでに金属結合型ホロ酵素の結晶構造しか報告されておらず、金属イオン結合に伴うMtsAの構造変化が不明であるため、このことが創薬研究の障壁となっている。そこで、本研究ではDEER法を用いて金属イオン結合に伴うMtsAの溶液中での構造変化を明らかにすることを目指した。
② 好冷細菌Pseudoalteromonas sp. AS-131由来グルコキナーゼ（PsGK）
我々が所有している南極産好冷細菌由来グルコキナーゼ（PsGK）は高熱安定性を有する低温適応酵素である。つまり、PsGKは低温から高温での高い酵素活性と高い安定性を併せ持ち、産業利用に理想的な特徴を有している酵素である。しかし、PsGKのように低温適応と高熱安定性を同時に達成する天然酵素は報告がほとんどなく、また現在の一般論ではそのメカニズムは説明できない。そこで、本研究ではPsGKの分子基盤を解明することを目的とし、これを達成するために、酵素活性および安定性と関係があるとされる構造柔軟性に注目した。グルコキナーゼの酵素反応は開閉運動を伴うため、これまでに行ってきた部位特異的な構造柔軟性を実測に加え、DEER法を利用して構造変化ダイナミクスを実測し、PsGKの酵素活性や安定性のメカニズムの解明を目指した。
実験 / Experimental
作成した変異体に対して、5倍モル量になるようにスピンラベルMTSLを加え数時間インキュベートした後、過剰MTSLを脱塩処理で除去した（@自機関）。ラベリングした試料のDEERを測定し（@分子研）、解析ソフト（DeerAnalysis）を用いて距離分布を算出した（@自機関）。
結果と考察 / Results and Discussion
① 金属結合型ホロ酵素の結晶構造から予測したラベル間距離分布では、ホロ酵素では閉構造のみをとっていると予想されたが、DEER結果（溶液中）から、アポ・ホロ酵素ともに開・閉構造の2状態の平衡にあり、金属イオン結合に伴いその平衡が閉構造側にシフトすることがわかった。この知見をより明確にするために、別のヘリックス間のラベル間距離を調べたところ、そのような開閉シフトは観察できなかった。これらのことから、金属結合に伴い一部のヘリックスのみが構造変化を起こすのではないかと示唆された。
② 基質非結合型（OPEN構造）、第一基質結合型（semi-CLOSED構造）、第二基質結合型（CLOSED構造）のDEERを測定し、各構造の距離分布を得た。しかし、結晶構造から予測された距離分布とは異なる結果が得られたため、別の変異体で検証する必要がある。
図・表・数式 / Figures, Tables and Equations
その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)
共同研究者：東京大学大学院工学系研究科 淺野梨紗、中木戸誠、津本浩平謝辞：電子スピン共鳴装置E680の担当者の皆様（特にサポートいただいた浅田瑞枝様、藤原基靖様、伊木志成子様）に感謝いたします。
成果発表・成果利用 / Publication and Patents
論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)
口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.
- 淺野梨紗, 矢垰紅音, 中木戸誠, 竹内美結, 相川知宏, 長門石曉, 中川一路, 堀谷正樹, 津本浩平 “金属イオン結合蛋白質MtsAの開閉ダイナミクス解析” 第50回生体分子科学討論会・第3回生命金属科学シンポジウム, 令和6年6月22日
- 矢垰紅音, 淺野梨紗, 中木戸誠, 津本浩平, 堀谷正樹 “先端ESR法を用いたMtsAの金属イオン結合に伴う開閉ダイナミクス解析” 第36回生物無機化学夏季セミナー・第4回生命金属科学夏合宿合同大会, 令和6年9月10日
特許 / Patents
特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件