【公開日：2025.06.10】【最終更新日：2025.03.17】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

24KT2232

利用課題名 / Title

化学刺激応答イオンチャネルのゲート開閉運動機構の解明に向けた流体デバイス応用1分子計測

利用した実施機関 / Support Institute

京都大学 / Kyoto Univ.

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

内部利用（ARIM事業参画者以外）/Internal Use (by non ARIM members)

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）加工・デバイスプロセス/Nanofabrication（副 / Sub）-

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）マルチマテリアル化技術・次世代高分子マテリアル/Multi-material technologies / Next-generation high-molecular materials（副 / Sub）-

キーワード / Keywords

マイクロ流体デバイス,1分子計測,膜タンパク質,1分子動態計測法,ダイシング/ Dicing,CVD,光リソグラフィ/ Photolithgraphy

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

平井 義和

所属名 / Affiliation

京都大学　大学院工学研究科

共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes

浅越雄介,清水啓史

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

KT-103：レーザー直接描画装置
KT-104：高速マスクレス露光装置
KT-119：両面マスク露光&ボンドアライメント装置
KT-205：プラズマCVD装置
KT-218：レーザダイシング装置

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

細胞膜に存在する大きさ数十nm程度のイオンチャネルは、特定の刺激を受容すると細胞内外へのイオン透過を制御する生理学的に重要な機能を持つ。チャネルの研究分野では、これまで静止画として分子立体構造を解明する研究は進められてきたが、刺激受容時に構造がどのように変化してイオン透過を制御しているかについては多くが未解明のままであり、生理現象の詳細な理解に向けた計測技術が求められている。そこで、チャネルが周囲の溶液条件の変化、すなわち化学刺激を受容した際の構造変化を明らかにするために、チャネル1分子の構造変化をリアルタイム計測するX線1分子動態計測法（DXT法）に用いるマイクロ流体デバイスを京都大学ナノテクノロジーハブ拠点の設備を用いて作製した。

実験 / Experimental

金ナノ結晶と放射光X線を用いるDXT法では、イオンチャネルを固定してX線を照射する観測窓をシリコン窒化膜のメンブレン構造にすることで、X線散乱によるノイズが低減できる。そこで本研究では、両面窒化膜付きシリコンウェハを、フォトリソグラフィとドライエッチング、ウェットエッチングで加工し、2 mm角（厚さ：200 nm）のシリコン窒化膜メンブレン構造を有する流体デバイスを作製した（Fig. 1）。プラズマCVD（KT-205）を用いて酸化膜を成膜した基板表面に、化学的処理によってイオンチャネルを固定し、治具で流路を形成した。この流体デバイスに2種類の溶液を交互に流体コントローラーを用いて送液し、化学刺激に応答したイオンチャネルの動きをDXT法で計測した。

結果と考察 / Results and Discussion

フォトリソグラフィを用いてネガレジストの流路パターンを作製し、漏れのない流路構造の形成を確認した（Fig. 2）。また、化学刺激の印加シーケンス（中性→酸性→中性）に応じたKcsAカリウムチャネルの運動応答を計測に成功した。活性条件下（酸性）で計測できたKcsAのねじれ運動は、イオンを透過させるゲーティング運動と見なせる結果であり、化学刺激に対するKcsAの運動応答を計測できるデバイス、および計測システムの開発を実証した。今後はこのマイクロ流体デバイスを用いた１分子計測システムを種々の膜たんぱく質へ応用することで、化学刺激に応答したイオンチャネルの構造変化に対する新たな知見が得られると期待される。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

 Fig. 1 本研究で開発した流体デバイスの概要図

Fig. 2 (a) 作製した流路基板の写真、(b) 白色干渉計搭載レーザー顕微鏡で計測したピラー構造部の高さプロファイル、(c) 治具で流路構造を形成した流体デバイスの写真

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

1. Yusuke Asagoe, Microfluidic Device for Diffracted X-ray Tracking Method to Measure the Conformational Change of Ion Channel in Response to Chemical Stimuli, 2024 IEEE 19th International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems (NEMS), , 1-4(2024).
   DOI: 10.1109/NEMS60219.2024.10639840
   

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

1. Yusuke Asagoe et al., “Diffracted X-Ray Tracking Method for Analyzing the Sequential Dynamic Motion of Ion Channels in Response to a Chemical Stimulus”, The 28th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2024), Montreal, Canada (October, 2024), W246.k
2. 越雄介 ほか２名, “KcsAカリウムチャネルのpH応答運動解析を可能にした放射光X線１分子動態計測用流体デバイス”, 化学とマイクロ・ナノシステム学会第49回研究会, 化学とマイクロ・ナノシステム学会, 東京, 2024年6月, 3P34

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件